Plot Super Mario Bros. 3 diterangkan dalam buku arahan kecil. Dunia Cendawan, latar belakang permainan, diserang oleh Koopalings, tujuh anak Bowser. Koopalings berhasil menakluki setiap tujuh kerajaan dengan mencuri tongkat ajaib rajanya dan menggunakannya untuk mengubahnya menjadi haiwan. Puteri Toadstool mengutus Mario dan Luigi untuk menjelajah setiap kerajaan, merebut kembali tongkat yang dicuri, dan mengembalikan raja-raja mereka ke keadaan semula.[10]

Mario dan Luigi menerima nota dan barang istimewa dari Puteri Toadstool setelah menyelamatkan enam raja pertama. Namun, ketika mereka menyelamatkan raja yang ketujuh, mereka justru menerima nota dari Bowser. Bowser menyatakan bahawa dia telah menculik Toadstool dan menahannya di dalam istana kerajaannya sendiri, Dark Land. Adik-beradik tersebut kemudian mengembara melalui Dark Land, memasuki istana Bowser, dan mengalahkannya dalam pertempuran. Permainan berakhir dengan Puteri Toadstool dibebaskan dari istana.[11]

Menurut Shigeru Miyamoto, Super Mario Bros. 3 diilhamkan oleh drama pentas. Skrin tajuk menampilkan tirai pentas yang dibuka, dan dalam versi NES asal, objek dalam permainan bergantung dari catwalk luar skrin, dilekat ke latar belakang, atau melepaskan bayang-bayang di latar langit. Setiap kali Mario menyelesaikan satu tahap, dia keluar dari panggung.[12]